Provocări în siguranța tratamentului transfuzional

Prevalența tot mai mare a agenților patogeni transmiși prin sânge continuă să amenințe siguranța tratamentului transfuzional. În prezent, doar un număr mic de agenți patogeni sunt testați de rutină: VHB, VHC, HIV 1+2, HTLV 1+2, Treponema Palidum. Cu toate acestea, există mulți alții care pot afecta siguranța transfuzională. Lista agenților patogeni este lungă și în creștere și pentru a asigura securitatea transfuzională este nevoie de adăugarea continuă de noi teste specifice costisitoare sau de strategii ample de gestionare a riscurilor, pentru eliminarea sau inactivarea agenților patogeni. Astfel a apărut nevoia inactivării agenților patogeni cu spectru larg.

Strategiile actuale de creștere a securității transfuzionale sunt diverse. Există mai multe bariere pentru controlul siguranței transfuzionale, care se derulează pe întreg lanțul transfuzional începând încă de la recrutarea donatorilor:
În centrele de transfuzie: Proceduri bazate pe criterii riguroase de selecție a donatorului, dezinfectare a pielii și existența unei pungi de deviere, testele de screening viral de rutină al donărilor și screeningul bacterian de rutină al concentratelor de trombocite.
În spitale: Practici transfuzionale adecvate (Conceptul Patient Blood Management) pentru a minimiza tratamentul transfuzional administrat pacienților, etc.
Pentru a minimiza riscul au fost create proceduri de reducere a agenților patogeni prin deleucocitare sau inactivarea agenților patogeni.

Tehnologia de reducere a agenților patogeni (PRT)
Reducerea agenților patogeni este recunoscută ca o strategie eficientă pentru a reduce riscul de infecții transmise prin transfuzie și potențial pentru a reduce riscul de boală grefă contra gazdă asociată transfuziei. Tehnologia cuprinde procese capabile să elimine agenți patogeni din sânge, de asemenea, să inactiveze leucocitele.
Tehnologia de reducere a agenților patogeni se bazează pe utilizarea unui agent inactivator capabil să distrugă un element funcțional țintit al agentului patogen.
Duce la deteriorarea ireversibilă a membranei agentului patogen, a învelișului sau a acizilor nucleici. Tehnologia de reducere a agenților patogeni produce modificări minime chimice sau biologice componentelor terapeutice. Tehnologia de reducere a agenților patogeni nu este implicată în funcționalitatea componentei sanguine (trombocite, plasmă și globule roșii).

Eficacitatea metodelor de reducere a agenților patogeni adecvate are ca scop:
Reducerea mare a riscului infecțios care este gradul de scădere a riscului de infecție cu transmitere transfuzională în urma utilizării PRT. Într-o estimare realizabilă, reducerea riscului prin reducerea agenților patogeni depinde de capacitatea tehnologiei, de datele epidemiologice din aria geografică în care se aplică, de dinamica agenților patogeni și de măsurile de siguranță utilizate. Capacitatea de reducere trebuie să ajungă la cel puțin 4-6 log10.
Fiecare tehnologie de reducere a agenților patogeni este unică în ceea ce privește:

• Amploarea activității antimicrobiene.
• Agenți patogeni afectați.
• Eficacitatea împotriva încărcăturii virale ridicate.
• Gradul de reducere a infecțiozității.
• Eficacitatea componentelor sanguine.
• Posibile reacții adverse.

Succesul metodelor de reducere a agenților patogeni
Pentru viruși, este capacitatea metodelor de reducere a agenților patogeni de a preveni transmiterea în timpul stadiului viremic al donatorului.
Pentru bacterii este capacitatea metodelor de reducere a agenților patogeni de a inactiva la un nivel scăzut (10 – 100 UFC pe produs) de contaminare bacteriană, care poate fi de la purtător asimptomatic sau contaminant normal al florei de pe tegumente în timpul donării.
Pentru paraziți și leucocite este capacitatea PRT de a inactiva acești agenți în componentele sanguine recoltate de la persoane infectate sau în componente sanguine nedeleucocitate.
Riscul rezidual de infecție este riscul estimat ca o donare potențial infecțioasă să fie colectată în perioada de fereastră serologic negativă. Riscul rezidual este folosit pentru a monitoriza siguranța tratamentului transfuzional și pentru a evalua politicile în domeniu.
În cursul infecției, există zona care este acoperită de testare, care variază în funcție de sensibilitatea și specificitatea testului, dar cea mai periculoasă și importantă zonă de transmitere a infecției, este “perioada de fereastră“, în care nici un test nu ar putea detecta nivelul foarte scăzut de agenți patogeni, care ar putea fi acoperit doar de metodele de reducere a agenților patogeni.

Mecanismul de acțiune al metodelor de reducere a agenților patogeni
Reacție fotosensibilă (fotodinamică) PRT utilizează fotosensibilizatori, (moleculele absorb o anumită energie luminoasă), induc o stare de activare a fotosensibilizatorului. Apoi apar două tipuri de reacții:
Reacții de tip I: În absența oxigenului – implică transferul direct de electroni între fotosensibilizator și țintă (ADN), ceea ce duce la formarea radicalilor ionici, care dăunează grav acizilor nucleici și reduc încărcătura agentului patogen.
Reacții de tip II: În prezența oxigenului – duce la formarea de molecule de oxigen, foarte activate și care pot reacționa cu moleculele de ADN, ceea ce duce la reducerea încărcăturii de agenți patogeni.
Reacție nefotosensibilă (fotochimică) – este o altă clasă de agenți de inactivare, care provoacă legături încrucișate covalente ireversibile în acizii nucleici, constând în inactivarea chimică, care impiedică transcripția, și proliferarea agentului patogen. Principalii agenți PRT utilizați în prezent sunt: detergent solvent, Albastru de metilen, Amotosalen și Riboflavină.

Metode de reducere a agenților patogeni:
I. Reacție fotosensibilă (fotodinamică) cu: Albastru de metilen (MB), UVC (lumină ultravioletă cu unde scurte), Amotosalen, Riboflavină (vitamina B2)
II. Reacție nefotosensibilă (fotochimică) cu: detergent cu solvenți (SD), Nanofiltrare, FRALE (Frangible Anchor Linker Effectors = Efectori de ancorare frangibili)

Reacție fotosensibilă (fotodinamică)
Albastru de metilen (MB) – procedură fotodinamică de reducere a agenților patogeni folosind MB și lumină vizibilă, este eficientă numai în plasmă. Prin reacție, se poate intercala în acizi nucleici sau se poate asocia cu helixul exterior și, după iluminarea cu lumină vizibilă, se poate genera oxigen care distruge acizii nucleici patogeni. Este mai eficient împotriva bacteriilor Gram-pozitive decât Gram-negative. Nu inactivează agenții patogeni intracelulari. (Nu poate pătrunde în membrana celulară, datorită sarcinii sale pozitive și caracterului hidrofil). MB rămâne localizat la proteinele și lipidele membranei externe, ceea ce duce la leziuni celulare de fotoactivare.
MB este comercializat în sistemul Theraflex MB Plasma (Macopharma).
Se trece plasma printr-un filtru pentru a reduce reziduurile, apoi dizolvă pastila MB în plasmă, amestecul este iluminat cu lumină vizibilă (590 – 630 nm), apoi este trecut prin filtrul de eliminare pentru a șterge componentele din MB.
UVC (lumină ultravioletă cu unde scurte) – Procesul se bazează doar pe aplicarea luminii ultraviolete cu unde scurte (UVC; interval de lungimi de undă 200-280 nm) ca sursă de inactivare a agentului patogen. Componentele sanguine trebuie trecute prin dispozitive speciale, pentru a forma straturi subtiri care pot fi penetrate de UVC.
Agitația intensă a fost combinată cu lumina pentru a se asigura că componente sanguine sunt expuse omogen. O astfel de metodă este cea mai eficientă în mediu relativ transparent (lungime de undă scurtă a luminii), astfel utilizată pentru a inactiva componentele trombocitare, plasma și concentratele de proteine plasmatice.
Amotosalen – Sistemul Intercept (Cerus) utilizează Psoralen (Amotosalen), pentru a inactiva agenții patogeni în prezența UVA. Este folosit pentru a trata componentele de plasmă și trombocite, apoi urmat de îndepărtarea Amotosalenei și a produselor sale de descompunere printr-o absorbție a compusului filtrant.
Se intercalează reversibil în structura dublă elicoidală a acizilor nucleici, deoarece poartă o sarcină cationică (moleculele de ADN sunt încărcate negativ).
După activarea UVA, se formează legături încrucișate covalente atât în ARN, cât și în ADN. Are activitate împotriva unei varietăți de viruși, atât bacterii Gram-negative, cât și Gram-pozitive, precum și a unor paraziți și inactivează leucocitele reziduale. Amotosalen pătrunde în membrana celulară (datorită proprietăților solubile în apă), permițând astfel să acționeze asupra acizilor nucleici intracelulari ai agenților patogeni. Nu inactivează virusurile neînvelite; hepatita A (HAV), parvovirusul B19 și, de asemenea, spori bacterieni. Nu este utilizat pe eritrocite, deoarece hemoglobina absoarbe UVA și împiedică activarea Psoralenului.
Riboflavin (vitamin B2) – Riboflavina este agentul fotosensibilizant din PRT Mirasol (Terumo BCT, SUA), utilizat pentru componente de plasmă și trombocite. Riboflavina este un nutrient natural, toxicitatea este minimă și eliminarea sa înainte de utilizarea clinică nu este necesară. Mecanismul fotochimic al Riboflavinei este mediat de reacții la activarea luminii UV, se leagă de ADN-ul și ARN-ul microbian, le oxidează prin reacția de transfer direct de electroni și inactivează replicarea ADN-ului patogen. Mirasol este eficient împotriva bacteriilor Gram-negative, unele bacterii Gram pozitive, precum și a unor paraziți. Sporii bacterieni sunt rezistenți la tratarea cu această tehnologie. Inactivează virușii neînveliți; VHA (reducere de 1,8 log10), parvovirusul uman B19 (reducere de >5,0 log10). Inactivează leucocitele reziduale; este utilizat combinat cu deleucocitare pentru a preveni CMV posttransfuzional.

Reacție nefotosensibilă (reacție fotochimică)
Detergent cu solvenți (SD) – Folosește un agent detergent neionic pentru a perturba membrana lipidică a virușilor înveliți, lizând astfel membrana celulară și învelișul viral, provoacă deteriorarea și perturbarea funcționalității virale. SD are aplicabilitate limitată numai pentru tratarea componentelor plasmatice. SD nu este utilizat pentru tratarea componentelor celulare (ar distruge stratul lipidic celular).
SD este cel mai utilizat și cel mai bine validat PRT în prezent, singura tehnologie actuală utilizată pentru inactivarea virală a poolurilor de plasmă pentru fracționare.
Îndepărtarea SD necesită extracție de ulei și cromatografie.
Este ineficient împotriva virusurilor neînvelite precum HAV, hepatita E și parvovirusul B19.
Nanofiltrare – Conceptul privind utilizarea acestor filtre se bazează pe principiul de excludere a dimensiunii; utilizat la reducerea agenților patogeni cu dimensiunea porilor de 15-40 nm pentru a elimina agenții patogeni.
Este aplicabil numai plasmei, deoarece datorită dimensiunii mici a porilor, trombocitele și celulele roșii ar fi, de asemenea, sechestrate.
Deși există o recuperare de 90-95% a activității proteinelor plasmatice; cu toate acestea, factorul von Willebrand cu greutate moleculară mare este eliminat de filtrele utilizate pentru a elimina virusul.
FRALE (Frangible Anchor Linker Effectors) – efectori frangibili de ancorare utilizează agentul alchilant independent de lumină S-303 (Cerus). Există o tehnologie pentru tratamentul concentratelor de eritrocite care este în prezent în curs de dezvoltare.
Acționează ca agent antiviral, bacterian și parazitar, prin intercalarea în structura acidului nucleic a ARN-ului și ADN-ului.
Sistemul FRALE constă în incubarea concentratului de celule roșii deleucitat cu glutation și S-303. Soluția de tratament și produsele de descompunere sunt îndepărtate prin centrifugare înainte de stocarea finală.
Metodele de reducere a agenților patogeni oferă o nouă abordare pentru a crește siguranța transfuzionale. Prezintă mai multe avantaje:

• Activitate cu spectru larg împotriva unei mari diversități de agenți patogeni.
• Eficient împotriva virușilor înveliți și neînveliți, bacteriilor Gram-pozitive și Gram-negative, inclusiv unii agenți formatori de spori, paraziți, fungi.
• Oferă ≥ 4 log de inactivare pentru majoritatea agenților patogeni relevanți clinic (nu există niciun proces de inactivare a agenților patogeni pentru care s-a demonstrat că elimină toți agenții patogeni).

Performanța așteptată a reducerii agenților patogeni:

• Eliminarea transmiterii infecției,
• Reducerea riscului rezidual al perioadei de infecție virală,
• Inactivarea agenților comuni (CMV, malarie) sau emergenți (dengue, Babesia, virusul Zika) sau altă infecție transmisă prin transfuzie care nu este testată uzual sau nu există în prezent,
• Eliminarea amenințărilor necunoscute și a noilor agenți care apar.

Introducerea PRT – ar putea elimina transmiterea infecțiilor virale, bacteriene și parazitare, în special prin concentratele de trombocite.

• ar înlătura screeningul bacterian (economisire de timp și costuri) sau iradierea gamma necesară în componentele trombocitare tratate PR.
• ar permite creșterea duratei de valabilitate a trombocitelor de la 5 la 7 zile. Deci: rebuturi reduse de trombocite și disponibilitate sporită.

Inactivarea simultană a leucocitelor reziduale din componentele sanguine poate reduce complicațiile (aloimunizare, boală grefă versus gazdă, microhimerism și modulare imună legată de transfuzii).

Riscul și limitările tehnologice
Aceste tehnici adaugă substanțe chimice fotoactive la un produs biologic (plasmă sau trombocite) și expune amestecul la lumină ultravioletă.
Dincolo de deteriorarea țintită a materialului genetic al unui agent patogen, pot apărea și diferite grade secundare de deteriorare și toxicitate a proteinelor și membranei celulare, ceea ce duce la o degradare a calității componentelor din sânge.
S-a observat un impact negativ asupra calității din cauza diluției, pierderii activității și reducerii volumului produsului de componente sanguine.
Studiile au raportat că concentrațiile factorilor de coagulare au fost cu 20-35% mai mici în plasma tratată cu TIP redusa de agenti patogen și există o pierdere de 10-15% a randamentului trombocitar după tratamentul trombocitar.
Evenimentele adverse legate de toxicitatea asociată agenților adăugați (reacții imune, toxicitate sau chiar carcinogenitate).
Dezvoltarea unui PRT adecvat pentru sânge și concentrate eritrocitare, care sunt mult mai dificile decât trombocitele și plasma datorită absorbției luminii de către hemoglobină și a duratei de valabilitate mai lungi a concentratelor eritrocitare.
Provocarea este de a identifica procesele care vor funcționa în componentele sanguine opace.
Majoritatea PRT-urilor actuale sunt ineficiente împotriva prionilor, sporilor bacterieni și virusurilor nelipidice.
Implementarea PRT în componentele sanguine ar trebui să fie echilibrată între costurile instituționale și sociale, deoarece costul componentelor tratate cu PRT crește semnificativ.
Concluzie
Crește riscul apariției noilor agenți patogeni emergenti, presiunea costurilor crește, însă dorința de a menține pacienții în siguranță… implică soluții optime.