Rolul biofilmului și al infecțiilor polimicrobiene în complicațiile infecțiilor pielii și țesuturilor moi: perspective moderne de diagnostic

Infecțiile pielii și ale țesuturilor moi reprezintă o categorie clinică diversă, cu etiologii multiple, care includ atât microorganisme unicelulare (monomicrobiene), cât și comunități polimicrobiene.

Aceste infecții includ ulcere cronice, răni, infecții post‑chirurgicale, celulită, fasceită necrozantă – constituie un important motiv de morbiditate şi mortalitate, precum și de consum de resurse medicale.

Biofilmul reprezintă o comunitate de microorganisme aderente pe o suprafață, învelite într-o matrice auto-produsă de substanțe polimerice extracelulare (EPS – extracellular polymeric substances), având rol esențial în cronicizarea infecțiilor, rezistența la tratamentul cu antimicrobiene și apariția complicațiilor. Gondil & Subhadra (2023). Biofilmul și etiologia polimicrobiană complică diagnosticarea și tratamentul, prelungesc durata vindecării, cresc riscul de complicaţii locale şi sistemice, și contribuie la rezistenţa la antimicrobiene.

Această sumarizare își propune să sintetizeze date recente privind rolul biofilmului și al polimicrobianismului în infecţiile pielii și ţesuturilor moi cu accent pe complicații și pe metode moderne de diagnostic.

Biofilmul: caracteristici relevante

Biofilmul este o structură microbiană tridimensională, caracterizată prin:

• Aderență inițială a microorganismelor pe suprafețe vii (epidermice, dermice, ţesut conjunctiv) sau superficii inerte.
• Proliferare și formarea microcoloniilor.
• Maturarea biofilmului, cu producere de matrice extracelulară care protejează microorganismele împotriva răspunsului imun local și a tratamentelor antimicrobiene.
• Dispersie sau eliberarea microorganismelor care pot coloniza alte zone (KALKANCI & GÜZEL TUNÇCAN, 2019)

Structura EPS constă în polizaharide, ADN extracelular, proteine, lipide și alți compuși, care conferă biofilmului proprietăți de toleranță (nu doar rezistență) față de antibiotice și față de presiunea imună. (KALKANCI & GÜZEL TUNÇCAN, 2019)

Infecțiile polimicrobiene ale pielii și țesuturilor moi (IPȚM)

Prevalență și contexte clinice

Infecțiile polimicrobiene sunt frecvent întâlnite în situații de rănire cronică (ulcere diabetice, escare, răni de presiune), arsuri, infecții persistente post-chirurgicale. În aceste cazuri, plaga poate fi colonizată simultan de bacterii aerobe, anaerobe și, uneori, fungi.  (Dowd et al., 2008)

Un studiu recent asupra ulcerelor diabetice cronice a demonstrat că toate mostrele examinate au fost polimicrobiene și prezentau biofilm vizibil prin metode microscopice speciale (SEM, FISH), colorația Gram evidențiind biofilmul în doar două treimi din cazurile pozitive prin metode superioare. Microorganismele frecvent identificate au inclus Pseudomonas aeruginosa, anaerobi precum Finegoldia magna, dar și altele. (Dilhari et al., 2020)

Interacțiuni între specii

Interacțiunile între bacterii (bacterie–bacterie) sau bacterie–fungi într-un biofilm polimicrobian pot fi:

• Sinergice: una dintre specii stimulează virulența sau creșterea celeilalte (ex: Candida albicans favorizează proliferarea și formarea biofilmului Staphylococcus aureus). (Mariani & Galvan, 2023)
• Antagoniste: competiția pentru resurse, inhibiție directă sau prin metabolit. (Mariani & Galvan, 2023)
• Cooperante metabolic: unele specii oferă molecule necesare altora, sau permit supraviețuirea în medii defavorabile (ex: anaerobi în rănile diabetice).(Dowd et al., 2008)

Aceste interacțiuni afectează nu doar evoluția clinică (vindecare întârziată, recurență), dar și răspunsul la tratament antimicrobian. (Mariani & Galvan, 2023)

Rolul biofilmului și al polimicrobianismului în complicații

Numărul și severitatea complicațiilor IPȚM cresc în prezența biofilmului polimicrobian. Printre acestea:

1. Vindecare întârziată/cronicizare. Biofilmul menține un produs inflamator persistent și protejează microorganismele de fagocitoză și de antibiotice, ceea ce împiedică progresia normală a reparării tisulare. (Wolcott et al., 2013a).
2. Resistență și toleranță la antibiotice. Microorganismele într-un biofilm pot avea toleranță crescută (nu neapărat numai “rezistență” genetică) la concentrații de antibiotic care ar fi suficiente pentru a eradica infecția. EPS joacă rol protector, și gradientele de oxigen/nutrienți din biofilm pot induce fenotipuri lente de creștere care sunt mai puțin susceptible (Wolcott et al., 2013a).
3. Risc de infecții recurente sau persistente. Chiar după tratamente antimicrobiene aparent adecvate, microorganismele reziduale în biofilm pot recoloniza plaga, provocând reapariția infecției. De exemplu, studiul “Suture‑associated biofilm” implică faptul că eliminarea corpului străin (firului de sutură) a fost necesară pentru vindecare. (Kathju et al., 2009a).
4. Complicații sistemice sau locale severe

Deși majoritatea datelor  din literatură se referă la complicații locale (necroză, extindere prin contiguitate, osteomielită), prezența biofilmului poate favoriza diseminarea sistemică cu microorganisme oportuniste sau patogene. (Mariani & Galvan, 2023).

Perspective moderne de diagnostic

Diagnosticul infecțiilor pielii și țesuturilor moi complicate de biofilm și etiologie polimicrobiană ridică provocări semnificative, întrucât metodele clasice bazate pe cultură sau examen clinic sunt adesea insuficiente. Iată principalele abordări moderne:

1. Microscopie (SEM / CLSM) și coloraţii care să evidențieze microcolonii și EPS

• SEM (Scanning Electron Microscopy) reprezintă o metodă de microscopie electronică care furnizează imagini de mare rezoluție ale suprafeţelor, permiţând observarea detaliilor structurale exterioare ale microcoloniilor, ale matricei exopolimerice (EPS), şi ale relațiilor spațiale între microorganisme și structurile tisulare.
• CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) este o tehnică de microscopie fluorescentă care permite obţinerea de imagini tridimensionale (prin scanare în profunzime) ale biofilmului, vizualizând simultan microorganismele și componentele EPS, în combinație cu coloranți fluorescenti specifici.
• Colorații (Gram, HE–Hematoxilin & Eozină, coloranți specifici EPS sau pentru detectarea exopolimerilor) sunt tehnici histologice/microscopice ce permit evidențierea microcoloniei, și în unele cazuri, a matricei exopolimerice.

2. FISH sau sondă moleculară (în special PNA‑FISH) pentru speciile suspecte

• FISH (Hybridizarea cu fluorescență in situ): metodă moleculară de vizualizare care foloseşte sonde ADN sau ARN marcate fluorescent, care hibridizează cu secvenţe complementare din celulele microbiene într‑o secţiune tisulară, permitând identificarea şi localizarea speciilor într‑o structură biofilmică.
• PNA‑FISH (Peptide Nucleic Acid FISH): o variantă în care se folosesc sonde de peptide nucleice, care sunt mai stabile, mai eficiente în penetrare, mai rapide şi cu mai puţin fundal nonspecific decât sondele ADN obișnuite.

3. Secvențiere/metagenomică (inclusiv metagenomic next‑generation sequencing‒mNGS)

• Secvențiere metagenomică: tehnică de biologie moleculară care permite analizarea ADN‑ului total extras dintr‑un eşantion biologic (răni, ţesut), fără a fi necesară cultivarea microorganismelor. Acest ADN este secvenţiat cu platforme de „next‑generation sequencing” (NGS) sau „metagenomic shotgun„, pentru a afla ce specii sunt prezente, în ce proporție, ce gene de virulență sau de rezistență sunt prezente.
• Metatranscriptomică (uneori parte din studiile metagenomice): analiză a ARN‑urilor exprimate, pentru a vedea ce microorganisme sunt metabolice active şi ce funcţii sunt exprimate.

• Propuneri de algoritm diagnostic integrat

Pe baza datelor publicate, se poate propune un algoritm de diagnostic pentru IPȚM suspectate de biofilm + polimicrobianism:

1. Evaluare clinică inițială: caracteristici sugerând infecție cronică/persistență (durată lungă, răspuns slab la tratament, semne locale persistente).
2. Prelevare de mostre:
   • Biopsie de țesut (ideal) pentru cultură, microscopie, histologie.
   • Mostre multiple, atât pentru germeni aerobi, anaerobi şi fungi.
   • Dacă biopsia nu este posibilă, se pot preleva aspirate profunde sau tampoane de exsudat, dar cu precauție pentru că este necesar ca proba să fie recoltată din profunzimea țesuturilor.
3. Metode complementare:
   • Microscopie (SEM / CLSM) și/sau colorări care să evidențieze microcolonii și EPS.
   • FISH sau sondă moleculară pentru speciile suspecte.
   • Secvențiere/metagenomică pentru identificarea de specii necultivabile și pentru caractere de rezistență.
4. Evaluare terapeutică concomitentă cu diagnosticul: monitorizarea răspunsului la tratamentul antimicrobian, necesitatea debridării, de îndepărtare a corpilor străini etc.
5. Utilizarea criteriilor combinate: diagnosticul de biofilm/infecții polimicrobiene nu se bazează pe un singur indicator, ci pe asocierea mai multor elemente: prezența biofilmului vizualizat, diversitatea microbiană, eșec terapeutic, confirmare moleculară etc.

Concluzii

• Biofilmul și infecțiile polimicrobiene sunt factori determinanți în agravarea și cronicizarea IPȚM.
• Diagnosticul bazat doar pe cultură tradițională și pe semnele clinice este adesea insuficient pentru a identifica prezența biofilmului sau a comunităților microbiene diverse.
• Metodele moderne – microscopie avansată, sondaje moleculare, metagenomică – oferă informații mai precise, dar trebuie integrate în practica clinică, luând în considerare costurile, accesibilitatea și capacitatea de interpretare.
• Pentru a preveni complicațiile severe, este imperativ ca diagnosticul să fie precoce și cu un caracter multidisciplinar – implicând microbiolog, dermatolog, chirurg și specialist în boli infecțioase.

Referințe

1. Dilhari, A., Gunasekara, C., Pathirage, S., Fernando, N., Weerasekara, D., McBain, A. J., & Weerasekera, M. (2020). Molecular and culture-based methods reveal polymicrobial aeitiology and biofilm involvement in chronic diabetic wounds. International Journal of Infectious Diseases, 101, 136. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2020.09.371
2. Dowd, S. E., Wolcott, R. D., Sun, Y., McKeehan, T., Smith, E., & Rhoads, D. (2008). Polymicrobial Nature of Chronic Diabetic Foot Ulcer Biofilm Infections Determined Using Bacterial Tag Encoded FLX Amplicon Pyrosequencing (bTEFAP). PLoS ONE, 3(10), e3326. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003326
3. Gondil, V. S., & Subhadra, B. (2023). Biofilms and their role on diseases. BMC Microbiology, 23(1), 203. https://doi.org/10.1186/s12866-023-02954-2
4. KALKANCI, A., & GÜZEL TUNÇCAN, Ö. (2019). Biofilm Related Infection: Diagnosis, Treatment and Prevention. Mediterranean Journal of Infection Microbes and Antimicrobials. https://doi.org/10.4274/mjima.galenos.2019.2019.18
5. Kathju, S., Nistico, L., Hall-Stoodley, L., Post, J. C., Ehrlich, G. D., & Stoodley, P. (2009a). Chronic Surgical Site Infection Due to Suture-Associated Polymicrobial Biofilm. Surgical Infections, 10(5), 457–461. https://doi.org/10.1089/sur.2008.062
6. Mariani, F., & Galvan, E. M. (2023). Staphylococcus aureus in Polymicrobial Skinand Soft Tissue Infections: Impact of Inter-Species Interactionsin Disease Outcome. Antibiotics, 12(7), 1164. https://doi.org/10.3390/antibiotics12071164
7. Percival, S. L. (2017). Importance of biofilm formation in surgical infection. British Journal of Surgery, 104(2), e85–e94. https://doi.org/10.1002/bjs.10433
8. Wolcott, R., Costerton, J. W., Raoult, D., & Cutler, S. J. (2013a). The polymicrobial nature of biofilm infection.