Cultura de eritrocite – viitorul medicinei transfuzionale

ERYTHROCYTE CULTURE – THE FUTURE OF TRANSFUSION MEDICINE

Abstract: Anemia is an extremely common pathology that affects more than 2 billion people worldwide with the highest incidence among the elderly. Every year, patients in the EU are treated with more than 25 million blood transfusions. More than 16 million units of red blood cells are delivered in the United States each year. The need for RBC transfusions is projected to increase as the population continues to age. Currently, products containing erythrocytes are obtained from voluntary donors, which involves biological risks and requires expensive screening. The number of people of legal age who are able to donate blood will become much smaller than is necessary to meet the need for blood components. In developing countries, there is the issue of security. In all countries, crisis situations, pandemics can affect blood collection. Demographic calculations based on recent changes in the average age of the population predict that the number of people likely to require transfusions will exceed the number of people likely to donate, making the blood supply inadequate by 2050. A strategy to solve these problems, by using synthetic hemoglobin substitutes, is associated with numerous side effects. Another potential strategy is the production of blood cells in vitro, and numerous efforts are underway to expand erythroid precursors and differentiate them in vitro into mature erythrocytes. Three major sources of cells are considered: circulating stem and progenitor cells from adults, cord blood stem and progenitor cells, pluripotent stem cells. The stem cell revolution potentially opens the way to blood for everyone, making it sufficiently quantitative, permanently available and without any risk of transmitting infectious agents. By their very design, humanity is entitled to expect real benefits from these cultured red blood cells compared to classical transfusion. Hopefully this will be a daily reality in the next few years.

Anemia este o patologie extrem de comună care afectează mai mult de 2 miliarde de oameni din întreaga lume cu cea mai mare incidență în rândul vârstnicilor. Este un simptom comun al terapiilor pentru cancer, a intervențiilor chirurgicale majore și a traumatismelor. În fiecare an, pacienții din UE sunt tratați cu peste 25 de milioane de transfuzii sanguine (în timpul urgențelor chirurgicale, al îngrijirii cazurilor de cancer sau al altor îngrijiri medicale). În Statele Unite se livrează peste 16 milioane de unitați de globule roșii în fiecare an. Se estimează că nevoia de transfuzii cu masă eritrocitară va crește pe măsură ce populația va continua să îmbătrânească. Se va înregistra o dezvoltare considerabilă a cancerelor de sânge a căror incidență crește odată cu vârsta și care au nevoi de transfuzie importante.
În prezent, produsele ce conțin eritrocite sunt obținute de la donatori voluntari, ceea ce implică riscuri biologice și necesită un screening costisitor. Eritrocitele, obținute în prezent de la donatori, reprezintă cea mai comună formă de terapie pe bază de celule. Numărul persoanelor din intervalul de vârstă legală, capabili să doneze sânge va deveni mult mai mic decât este necesar pentru a satisface nevoia de componente sanguine.
În țările în curs de dezvoltare, problema nu este doar cea a aprovizionării, ci și a securității infecțioase prin detectarea biologică inadecvată a agenților patogeni. În toate țările, situațiile de criză de sănătate pot afecta colectarea de sânge, cum ar fi pandemiile, pandemia COVID 19, focarele de Ebola în Africa și Chikungunya sau Dengue în Caraibe/Guyana.
Mai mult, este probabil ca donările de sânge să devină insuficiente pentru a satisface cerințele viitoare. Calculele demografice bazate pe modificările recente ale vârstei medii a populației din SUA, prevăd că numărul de persoane susceptibile de a necesita transfuzii, în primul rând indivizi mai în vârstă, îl va depăși pe cel al persoanelor care sunt susceptibile de a dona, persoane mai tinere, făcând aprovizionarea cu sânge inadecvată până în 2050. În plus, întreruperea recoltării de sânge din cauza dezastrelor naturale și a urgențelor social-politice ar putea duce în orice moment, la lipsuri de componente sanguine imprevizibile, de durată și severitate mare.
O strategie de rezolvare a acestor probleme, prin utilizarea substituenților sintetici de hemoglobină, este asociată cu numeroase efecte secundare, inclusiv hipertensiune arterială și risc crescut de infarct miocardic, în prezent evitându-se utilizarea clinică. O altă strategie potențială, producția de celule sanguine in vitro. Având în vedere aceste preocupări serioase, surse alternative de eritrocite sunt căutate, fiind esențiale pentru viitor. În consecință, sunt în curs de desfășurare numeroase eforturi pentru a extinde precursorii eritroizi și a-i diferenția in vitro, în eritrocite mature.
O mai bună înțelegere a eritropoiezei normale va duce la îmbunătățirea generării in vitro de eritrocite complet mature. Expansiunea extinsă in vitro a eritroblastelor embrionare și dezvoltarea precursorilor eritroizi ca potențial produs de transfuzie, ar putea ajuta la rezolvarea problemelor și, în cele din urmă, și-ar găsi un loc în tratamentul pacienților cu anemii acute și cronice.
Oamenii sintetizează mai mult de 2 milioane de globule roșii în fiecare secundă pentru a menține o masă de globule roșii la starea de echilibru constând din mai mult de 2,5 × 10¹³ eritrocite.
Aproximativ 1% din eritrocite sunt eliminate din circulație în fiecare zi, iar menținerea masei medii a eritrocitelor adulților de 2,5 × 10¹³ necesită o producție zilnică de 1% eritrocite de înlocuire. Aceste numere masive de eritrocite sunt derivate dintr-un număr mic de celule stem hematopoietice care se diferențiază în progenitori angajați în descendență, capabili să formeze colonii de celule eritroide în medii semisolide.
Producția de concentrate eritrocitare în scop clinic va necesita identificarea surselor de celule care pot fi exploatate și utilizate în mod fiabil pentru a dezvolta o procedură de producție foarte scalabilă care recapitulează procesul de eritropoieză prezentat pe scurt mai sus.
Sunt luate în considerare trei surse majore de celule: celule stem circulante și celule progenitoare de la adulți, celule stem și celule progenitoare din sângele din cordonul ombilical, celule stem pluripotente.
In vivo, eritropoieza provine dintr-un număr mic de celule stem hematopoietice care generează un număr tot mai mare de progenitori implicați în descendență, denumite unități formatoare de burst eritroide și unități formatoare de colonii eritroide, care generează ulterior precursori eritroizi denumiți proeritroblaste, eritroblaste bazofile, eritroblaste policromatofile și eritroblaste ortocromatice, ce acumulează hemoglobina și își condensează nucleul. Enuclearea are ca rezultat generarea de reticulocite care pierd toate organitele interne pentru a deveni eritrocite mature.
Eritropoieza a fost modelată in vitro prin utilizarea a două sau mai multe etape de cultură lichidă. Primul pas este de obicei asociat cu extinderea progenitorilor eritroizi multipotențiali și specifici. In vitro, dexametazona face sinergie cu eritropoietina și factorul de celule stem pentru a induce eritroblastele imature să sufere diviziuni celulare de auto-reînnoire. Când culturile sunt pornite din țesuturi hematopoietice nou-născute sau adulte, auto-reînnoirea eritroblastelor este în cele din urmă restricționată.
În contrast, atunci când culturile sunt inițiate din sacul vitelin sau din ficatul fetal timpuriu sau din celule stem embrionare diferențiate care conțin progenitori eritro-mieloizi, eritroblastele pot suferi o auto-reînnoire extinsă in vitro. Când dexametazona și SCF sunt îndepărtate din culturi, aceste eritroblaste completează maturarea terminală. Generarea in vitro de eritrocite este acum posibilă. A apărut conceptul de eritrocite cultivate, care răspunde provocărilor prezente și viitoare ale transfuziei de sânge.
În viitor, este acum o chestiune de proiectare a unei tehnologii de producție la scară largă, care să permită generarea de eritrocite cultivate din celule stem, într-un mod similar cu producția în masă a unui medicament. Această abordare este emblematică pentru problemele pe care medicina regenerativă va trebui să le depășească pentru toate indicațiile sale, și anume proiectarea unor instrumente de bioinginerie la scară largă pentru a putea realiza studii clinice. Revoluția celulelor stem deschide potențial calea către sânge pentru toată lumea, făcându-l suficient cantitativ, disponibil permanent și fără nici un risc de transmitere a agenților infecțioși. Într-adevăr, acum se pot produce in vitro cantități mari de eritrocite cultivate din mai multe tipuri de celule stem umane. Toți pașii de cercetare au fost finalizați cu succes, inclusiv demonstrarea fezabilității injectării umane.
Ușor accesibile, celulele stem hematopoietice au fost utilizate pe scară largă la nivel mondial de peste 30 de ani ca alternativă la transplantul de măduvă osoasă pentru tratamentul bolilor de sânge.
Tehnologiile de colectare, preparare și congelare sunt bine controlate. Celule stem din sângele periferic sunt ușor accesibile. Celule stem din sângele periferic sunt mobilizate prin administrarea de factor de creștere la donator, ceea ce facilitează eliberarea temporară a acestor celule din măduva osoasă și apoi sunt ușor de obținut din sânge. Celule stem sunt, de asemenea, obținute din sângele din cordonul ombilical. Este disponibilă o rețea internațională de bănci de sânge din cordonul ombilical, care include aproape 1 milion de unități. Aceasta este o sursă care ar putea fi utilă pentru selectarea principalelor fenotipuri de eritrocite (ABO, Rh, Kell). Celule stem e au multe puncte forte: native, prin urmare nemodificate genetic, nu pun nici o problemă de acceptare de către agențiile de reglementare; au o capacitate mare de proliferare și diferențiere, ceea ce înseamnă că echivalentul a câteva sute de unități ar putea fi generat dintr-o singură probă de sânge mobilizată. Principala lor limitare este producția de lot și dependența de donatori.
Celulele stem pluripotente induse (iPSC), (Yamanaka, 2007), obținute prin reprogramarea oricărui tip de celulă adultă diferențiată, posedă caracteristicile celulelor stem pluripotente embrionare, capacitate nelimitată de proliferare in vitro și capacitatea de a diferenția orice tip de celule din organism. Celulele stem pluripotente induse au numeroase avantaje față de celulele stem embrionare: distrugerea embrionilor nu este necesară, ceea ce înseamnă că apar mai puține probleme etice; ei nu suferă de alegerea extrem de limitată a donatorilor; pot fi obținute de la donatori voluntari selecționați cu grijă. Prin urmare, celulele stem pluripotente induse sunt de interes pentru producția potențială a unui număr nelimitat de unități pentru transfuzii de sânge. Cu toate acestea, dacă diferențierea lor este controlată, creșterea capacității lor de proliferare rămâne o provocare pe care numeroase echipe din întreaga lume încearcă să o depășească. Prin urmare, producția industrială de celule stem pluripotente induse sigure poate necesita câțiva ani în plus de cercetare.
O altă alternativă mai recent explorată este generarea de linii progenitoare eritroide imortalizate. Scopul este de a modifica genetic celulele stem umane astfel încât acestea să prolifereze la infinit în stare nediferențiată și să poată, la cerere, să fie induse să se diferențieze în eritrocite. Acest lucru oferă potențialul de a oferi o sursă nelimitată de celule stem pentru producerea eritrocitelor de cultură, cu toate avantajele celulele stem pluripotente induse, dar cu capacități de proliferare și maturare așteptate, semnificativ mai mari. Totuși aceste linii sunt, de asemenea, organisme modificate genetic care vor fi supuse cerințelor agențiilor de reglementare.
Prin însăși concepția lor, omenirea este îndreptățită să se aștepte la beneficii reale de la aceste populații eritrocite de cultură în comparație cu transfuzia clasică. În special, s-a stabilit că durata de viață a unei populații eritrocite de cultură este mai mare decât cea a unei populații native eritrocite. Acest lucru se datorează naturii omogene a unei populații tinere de eritrocite de cultură în comparație cu o populație de eritrocite native care este eterogenă ca vârstă. În contextul unei viitoare aplicații clinice, această observație este majoră deoarece prezice o eficiență a transfuziei semnificativ mai mare pentru acest nou produs sanguin și, prin urmare, o scădere a numărului de transfuzii necesare și, în consecință, costuri mai mici ale îngrijirii pacientului. Prin urmare, se poate aștepta o eficacitate îmbunătățită a transfuziei, ceea ce ar face din aceasta un atu major.
În condiții normale, 2-3% din totalul pacienților transfuzați dezvoltă anticorpi împotriva unuia sau mai multor antigeni de grup sanguin. Proporția de pacienți care dezvoltă acești anticorpi crește odată cu numărul de transfuzii primite, iar în unele populații de pacienți transfuzați cronic, aloimunizarea împotriva antigenelor eritrocitelor poate apărea la 20-40% dintre pacienți, conducând în unele cazuri la un impas transfuzional. Având capacitatea de a selecta donatori de celule stem cu fenotipuri de celule roșii de interes, eritrocitele de cultură pot fi utilizate pentru a transfuza pacienții aloimunizați. S-a demonstrat că folosind un singur donator selectat pentru particularitatea fenotipului său eritrocitar (dintre cele mai multe zece sisteme imunogene), ar fi posibil să fie compatibil cu 95% dintre pacienții aloimunizați și că zece donatori ar acoperi 99% din pacienții aloimunizați, cazurile rămase corespunzând așa-numitelor grupe sanguine „rare”. Prin urmare, ne referim la conceptul mult așteptat de „eritrocite universale” de la descoperirea primei grupe sanguine în 1900. Selectarea donatorilor pe principalele sisteme de grupe sanguine va răspunde la impasul transfuziional și, în cele din urmă, va evita riscul de aloimunizare în populațiile în cauză. Reducerea riscurilor de aloimunizare este, prin urmare, un alt avantaj major așteptat.
Transmiterea agenților infecțioși cunoscuți sau emergenți este o preocupare constantă a transfuziei de sânge. Prin limitarea numărului de donatori diferiți, riscul transmiterii agenților infecțioși va fi mult redus. Prin urmare, se poate anticipa o reducere semnificativă a riscurilor infecțioase odată cu apariția eritrocitelor de cultură. Se poate aștepta ca disponibilitatea permanentă a eritrocitelor de cultură să permită și o reducere semnificativă a constrângerilor logistice. În plus, disponibilitatea constantă a surselor de celule stem ar atenua problema penuriei de sânge.
Dezvoltarea unui astfel de produs sanguin labil, la un nivel fezabil din punct de vedere economic, ar rezolva aproape toate problemele actuale ale transfuziei de sânge. A trecut mai bine de o jumătate de secol de când a început căutarea unui substitut artificial pentru eritrocite. Până în prezent, acest lucru a fost oarecum nereușit și nu a apărut nici o alternativă pe termen scurt. Lecția care poate fi învățată este că este aparent imposibil să înlocuiești natura în acest domeniu, deoarece sângele este un țesut extrem de complex, dar toate acestea au întărit interesul pentru acest domeniu de cercetare.
Cercetarea fundamentală, chiar dacă nu este niciodată finalizată, a stabilit bazele principale ale acestei abordări. Momentul de a acţiona este acum, adică prin producţie industrială, pentru ca în sfârşit să se treacă la a realiza studiile clinice. Scopul ar trebui să fie acela de a proiecta o tehnologie industrială care să poată fi utilizată pentru generarea de concentrate eritrocitare, așa cum este în producția de medicamente. Va fi necesară implementarea tehnologiei pe un prototip de producție industrială, în condiții farmaceutice pentru a produce concentrate de eritrocite, pentru a realiza studii clinice și apoi a promova acest concept pentru dezvoltarea industrială.
Această abordare este emblematică pentru problemele pe care medicina regenerativă va trebui să le depășească pentru toate indicațiile sale, și anume proiectarea unor instrumente de bioinginerie la scară largă pentru a putea realiza studii clinice care să demonstreze superioritatea acestor noi abordări. Sperăm că aceasta va fi o realitate zilnică în următorii câțiva ani.