Utilitatea IHC și ISH în diagnosticul oncologic de precizie

În prezent, cancerul ocupă locul secund pe podiumul bolilor cauzatoare de deces, fiind responsabil de decesul a 9,6 milioane la nivel global anual. Denumirea de cancer (neoplasm, tumoră malignă) cuprinde un număr mare de boli, care își au originea în acele celule care suferă modificări ce le permit eludarea mecanismelor stricte de control ale proliferării celulare și/sau care sunt capabile să „păcălească” sistemul imunitar al organismului. Consecința acestui dezechilibru este înmulțirea necontrolată a celulelor, cu depășirea limitelor obișnuite ale țesutului de origine și invadarea zonelor adiacente, precum și răspândirea lor la distanță, în alte organe. Procesul de răspândire a celulelor tumorale și dezvoltarea de noi mase tumorale maligne la distanță de tumora inițială se numește metastazare și reprezintă una dintre cauzele major de deces în cazul cancerului1. Toate acestea au ca fundament instabilitatea genetică, asigurându-se diversitatea genetică a tumorilor, cu consecințe imediate în selectarea liniilor celulare tumorale cu agresivitate înaltă și/sau refractare la chimioterapia antitumorală2.

Modificările apărute la nivelul genomului celular tumoral pot fi identificate fie prin recunoașterea segmentelor de ADN/ARN modificate prin tehnica de hibridizare in situ (ISH), fie prin identificarea proteinelor (elemente fundamentale din structura celulelor și a țesuturilor) prin tehnici de imunohistochimie. Ambele tehnici au la baza conceptul de complementaritate, fie între două secvențe ADN, fie între anticorp și antigen 3.
Hibridizarea in situ este utilă în localizarea secvențelor specifice ale acizilor nucleici la nivel de cromozomi sau de țesuturi, stabilind de exemplu structura cromozomului. Există mai multe variații ale aceste tehnici, țintite fiind fragmentele de ADN, ARN (ARN mesager, ARN necodantlung sau microARN) de la nivelul secțiunilor tisulare, celulare sau din celule tumorale circulante. De asemenea, tehnica FISH (utilizează fluorocromi în vederea detectării) este utilizată în diagnosticul medical pentru a determina structura cromozomilor.
O altă tehnică utilizată în diagnosticul molecular de interes in diagnosticul oncologic este reprezentată de către imunohistochimie, tehnică asemănătoare celei ISH, dar în acest caz reacția nu mai are loc la nivel de acizi nucleici, ci de antigen (ce poate fi o proteină) și un anticorp dezvoltat să se lege specific doar la acel antigen. Detecția legăturii dintre antigen și anticorp, pentru a putea fi vizualizată, se bazează fie pe atașarea la anticorpul țintit a unui fluorocrom (compus chimic ce devine fluorescent în anumite condiții), a unei enzime capabile să transforme un compus dintr-o culoare în alta, fie prin utilizarea unui anticorp secundar care se va lega la anticorpul țintit către antigen. Acest anticorp secundar va purta de asemenea, unul dintre sistemele de detecție anterior descrise. Ulterior, existența antigenului de interes, localizarea lui în țesut, abundența acestuia vor putea fi apreciate prin examinarea lamei la microscop. Prezența antigenului va fi evidențiată prin apariția la nivelul lamei examinate a unor zone colorate (în general maronii) sau a semnalelor fluorescente. Aceste semnale vor apărea doar dacă anticorpii s-au legat specific de țintele lor, în caz contrar nu vom avea semnal. Astfel, crește nivelul de încredere al medicului anatomopatolog și ulterior a medicului oncolog în stabilirea unui diagnostic precis și în adoptarea unei conduite terapeutice adecvate.
Aparent, gestionarea bolii maligne și a metastazelor este dificil de realizat, dar descoperirea precoce și aplicarea unor tratamente eficiente cresc semnificativ șansele de supraviețuire, cu reducerea mortalității. Aceste deziderate pot fi atinse prin diagnosticul precoce a cancerelor simptomatice și prin aplicarea unor programe de screening la nivelul persoanelor care prezintă susceptibilitatea de a dezvolta această boală.
De cele mai multe ori diagnosticul de certitudine în ceea ce privește existența unui cancer este pus pe baza biopsiei prelevate de la pacient. Ulterior, aceasta este prelucrată pentru identificarea modificărilor caracteristice întâlnite în diferitele tipuri de cancere, obținându-se informații și în ceea ce privește gradul de diferențiere (cât de diferită este masa de celule canceroase față de celulele normale). Dar analizele clasice de histologie sunt limitate, deoarece nu pot discrimina între diferitele subtipuri celulare, dar mai ales moleculare. Progresul geneticii și biologiei moleculare a permis identificarea de ținte moleculare și de noi căi de intervenție terapeutică.
Astfel, la unii pacienți care prezintă cancer de sân sau cancer gastric, gena HER2 este amplificată (se găsește într-un număr mai mare comparativ cu celulel normale), urmare a transformării maligne și progresiei cancerului, această situație conducând la exprimarea într-un număr mai mare a proteinei HER2 la suprafața celulelor canceroase. Această amplificare a genei HER2 a fost asociată cu un prognostic nefavorabil, risc crescut de recurență și cu șanse mai reduse de supraviețuire. De asemenea, unele studii au arătat că se poate stabili o relație între nivelul de expresie a HER2 și răspunsul la anumite scheme terapeutice. Estimarea nivelului de expresie a HER2 este important pentru inițierea tratamentului cu anticorpi monoclonali țintiți pentru proteina HER2. Studiile clinice au arătat că pacienți care prezintă o supraexprimare la nivelul celulelor tumorale a HER2 și/sau o amplificare a genei HER2 au un beneficiu mai mare de pe urma tratamentului cu anticorpii monoclonali. Ulterior, după marcarea țintelor moleculare aceste sunt vizualizate și interpretate de către specialistul anatomopatolog, rezultatul fiind înaintat către medicul oncolog ce va lua decizia terapeutică de urmat 4. Sau, în cazul detecției proteinei PD-L1 în probele de țesut prelevate de la pacienți cu cancer pulmonar (NSCLC) se bazează pe tehnica de IHC, permițând evaluarea oportunității de tratament cu anticorpi monoclonali. Astfel, pe baza rezultatelor de la IHC se determină procentul de celule ce prezintă o marcare parțială sau totală a membranei celulare cu anticorpii specifici. Ulterior, tratamentul țintit și personalizat va conduce la controlul mult mai precis a creșterii tumorale și la o prelungire a ratei de supraviețuire5.
Dar de la biopsia prelevată și până la un diagnostic, proba pacientului trece print-un proces complex, de durată și care nu exclude apariția unor artefacte. De aceea, automatizarea și găsirea unor soluții tehnice de standardizare a procesului de prelucrare și marcare oferă în prezent posibilitatea prelucrării unui număr crescut de probe, cu un grad de reproductibilitate crescut.

Din categoria automatelor de prelucrare a probelor histologice sub formă de preparate histologice este și Dako Omnis, sistem automatizat penttu ISH și IHC. Acesta automatizează complet fluxul de marcare / hibridizare, având protocoale standardizate, verificate și reproductibile. Kiturile dezvoltate pentru acest echipament oferă posibilitatea unei marcări / hibridizării nesupravegheate de către utilizator, rezultatul fiind tot timpul același.
De exemplu, HercepTest™ mAb pharmDx dezovolat pentru Dako Omnis este unul dintre cele mai recente kituri pentru determinarea semicantitativă a supraexprimării proteinei HER2 în țesutul mamar inclus în parafină și prelucrat pentru histologie. Anticorpul primar utilizat este un anticorp monoclonal (clona DG44) licențiat și obținut printr-un proces patentat, atingând astfel o specificitate mult mai crescută comparativ cu alți anticorpi. Totdată, poate fi utilizat în fluxuri automate de colorare, fiind validat pe echipamente de colorare automate în echipamente automate de colorare (de exemplu Dako Omnis).
Când se vorbește de diagnostic de precizie în domeniul oncologiei moderne, trebuie să ținem cont că uneori strategia terapeutică este influențată și stabilită pe baza informațiilor furnizate de metodele de histologie și genetică moleculară, care au posibilitatea de a discrimina la nivel molecular diferențele între două sau mai multe subtipuri tumorale.
Astfel, extrem de importantă este performanța anticorpului primar și, în final, a întregului kit de a identifica corect și specific subtilele diferențe dintre subpopulații tumorale. Performanța kitului de diagnostic imunohistochimic de la Dako Omnis a fost evaluată prin comparație cu performanțele altor kituri similare de marcare pentru HER2. În acest scop, evaluarea comparativă a rezultatelor a folosit 119 de probe de cancer de sân preselectate, ce au acoperit întreaga plajă de niveluri de expresie (scor IHC 0, 1 + , 2 + , 3 +). Sensibilitatea și specificitatea kiturilor de diagnostic a fost determinată pe baza consensului IHC și pe baza determinării FISH, conform recomandărilor ASCO/CAP (2018).
În cazul tumorilor HER2 negativ (IHC 0, 1+, 2+ și FISH negativ) și HER2-pozitiv (IHC 3+, 2+ și FISH pozitiv) ambele teste au indicat corect statusul tumoral. Kitul validat pe Dako Omnis a fost capabil să identifice 2 tumori care prezentau amplificări specifice ca având scorul 2 pe scala IHC, în timp ce kitul testat în parale le-a identificat ca fiind IHC 1+. Alte 4 cazuri au fost identificate ca fiind IHC 2+ de către HercepTest (mAb),cu un raport FISH <2 dar cu un unmăr crescut de copii, au fost identificate ca fiind negative de către kitul testat în paralel. Astfel, HercepTest (mAb) detectează cu o mai mare sensibilitate expresia HER2 în tumorile cu amplificare genică (grup ISH 1) și cu număr de copii crescut, precum și în cazul tumorilor cu nivel scăzut de expresie HER2 (HER2 IHC2 + /FISH negativ sau IHC 1 +) 8.
Datele au demonstrat că HercepTest (mAb) a prezentat atât specificitate ridicată (100%), cât și sensibilitate ridicată (100%), ceea ce ar putea fi critic în selecția pacienților pentru noile opțiuni de tratament care vizează HER2.
Cu toate că tehnicile de diagnostic și tratament au evoluat foarte mult, nu trebuie să uităm că este mai ușor să prevenim, decât să tratăm și în acest sens riscul de cancer poate fi redus prin: renunțatul la fumat; evitarea sau reducerea consumului de alcool; alimentație sănătoasă și menținerea unei greutăți corporale normale; vaccinarea împotriva HPV și hepatitei B; evitarea expunerii la radiații ultraviolete; minimizarea expunerii la radiații ionizante; limitarea expunerii la aerul poluat din exterior și interior.

Bibliografie

1. Cancer. www.who.int/health-topics/cancer.
2. Hanahan, D. & Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell 144, 646–674 (2011).
3. Sjørup, A. H. Education Guide Immunohistochemical Staining Methods Sixth Edition.
4. Agilent Dako Omnis. HER2 IQFISH pharmDx, IFU. www.agilent.com/cs/library/brochures/29051_her2_iqfish_pharmdx_brochure_us_version.pdf.
5. Agilent Dako. PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Interpretation Manual – NSCLC. www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/29158_pd-l1-ihc-22C3-pharmdx-nsclc-interpretation-manual.pdf.
6. Anistalista. Español: Hibridacion in situ con fluorescencia sobre el gen HER2 y el centromero del cromosoma 17. Celulas de un tumor de mama.English: HER2 FISH on Breast Cancer. (2017).
7. Nephron. PD-L1 lung ca. – high mag. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:PD-L1_positive_lung_adenocarcinoma_–_high_mag.jpg#filelinks (2018).
8. Rüschoff, J. et al. Comparison of HercepTestTM mAb pharmDx (Dako Omnis, GE001) with Ventana PATHWAY anti-HER-2/neu (4B5) in breast cancer: correlation with HER2 amplification and HER2 low status. Virchows Arch. 481, 685–694 (2022).