Importanța evaluării imunohistochimice în diagnosticul diferențial al unui caz paradoxal de melanom malign cutanat

Abstract: Considering that melanoma is still the most dangerous skin cancer, the primary goal of this research was the clinical, histological and immunohistochemical evaluation of an uncommon case of de novo melanoma. The dermoscopy displayed the asymmetry, polymorphism and polychromatism of the neoplasm; the histological analysis revealed a microscopic structure similar to an epithelioid cell melanoma, with inflammatory reaction and central ulcerations. The immunohistochemical exam with melanocytic differentiation markers exposed the presence of pagetoid-disseminated tumor cells into the epidermis, as well as deep dermis invasion and the development of tumor cells throughout the hair follicles. This atypical case exhibited surprising characteristics, such as emerging on healthy skin, the gradual evolution, the infrequent age and phototype III of the patient and the rare exposure to ultraviolet radiations. Consequently, the immunohistochemical markers played a crucial role in the differential diagnosis.

Introducere
Melanomul malign cutanat (MMC) continuă să reprezinte o chestiune de actualitate în patologia dermatologică, întrucât pune probleme deosebit de dificile de diagnostic, evoluție și, mai ales, de tratament[1,2]. Atâta vreme cât, la ora actuală, nicio schemă terapeutică[3], nicio combinație de chimioterapice și/sau imunomodulatoare[4], utilizate singure sau în asociere cu alte metode fizioterapice sau chirurgicale, nu asigură vindecarea, MMC va rămâne în continuare subiectul princeps al cercetărilor din domeniul oncologiei[5,6].
Cazul pe care îl prezentăm îl considerăm pe cât de interesant, pe atât de instructiv, datorită, pe deoparte, modului de debut „de novo“, pe tegument aparent sănătos, la o vârstă de peste 50 de ani, iar, pe de altă parte, pe un teritoriu cutanat neexpus decât ocazional la raze UV.

Prezentare de caz
Cazul de față implică un pacient, M.H., 54 de ani, din mediul urban, care a fost internat în Clinica de Dermatologie a Spitalului Clinic Județean de Urgență Craiova, pentru prezența unei formațiuni tumorale cu diametrul de 1cm, pigmentată, localizată la nivelul omoplatului drept.
Din afirmațiile pacientului, tumora a apărut în urmă cu aproximativ 2 ani, a crescut lent în dimensiuni și și-a modificat forma și culoarea în timp.
Dintre factorii de risc, am reținut că pacientul era un mare fumător (peste un pachet de țigări pe zi) și supraponderal cu un indice IMC de 26,8. Fototipul în care se încadra pacientul era III. Antecedentele personale patologice au arătat o hipertensiune arterială gradul II.
La examenul obiectiv, s-au constatat tegumente de culoare normală, cu o foliculită a coapselor și ganglionii limfatici superficiali nepalpabili. Local, la nivelul omoplatului drept, s-a observat o formațiune tumorală cu margini neregulate, de culoare brun-negricioasă, cu polimorfism cromatic, ușor reliefată de la planul tegumentului (3-4 mm), cu diametrul de aproximativ 1cm. Marginile tumorii erau ușor infiltrate, iar suprafața boselată nu era dureroasă spontan sau la palpare.
Aspectul clinic al tumorii, polimorfismul cromatic, suprafața boselată, marginile neregulate, sunt indicii care au sugerat melanomul malign în timpul procesului de diagnostic diferențial.

Material și Metode
Examenul dermatoscopic s-a efectuat cu un dermatoscop FotoFinder care a arătat o leziune asimetrică cu polimorfism și policromatism, cu rețea pigmentară atipică și prezența „vălului“ care caracterizează melanomul malign (Figurile 1-4).
S-a decis intervenția chirurgicală, excizându-se tumora „in toto“, cu zonă de siguranță oncologică și sutură „per-primam“, iar piesa s-a trimis la Laboratorul de Anatomie Patologică pentru examenul histopatologic.
Fragmentul tisular excizat a fost fixat în formol tamponat 10% şi a fost prelucrat prin tehnica histopatologică clasică de includere la parafină. Din blocurile de parafină au fost efectuate secţiuni de 3-4 microni care au fost colorate iniţial cu coloraţia uzuală Hematoxilină-Eozină (HE). Ulterior, au fost efectuate secţiuni seriate, care au fost etalate pe lame tratate cu poli-L-lizină în vederea examenului imunohistochimic.
Tehnica imunohistochimică utilizată a fost tehnica în doi paşi cu straptavidină-biotină ca anticorp secundar (kit LSAB plus, DakoCytomation, Danemarca), iar cromogenul utilizat pentru vizualizarea imunoreacţiei a fost AEC (3-amino-9-etillcarbazol). Anticorpii primari utilizaţi au fost sugeraţi de aspectul microscopic observat pe coloraţia uzuală şi au fost reprezentaţi de: Proteina S100 (policlonal, DakoCytomation, diluţie 1:500), HMB45 (clona HMB45, DakoCytomation, diluţie 1:50), Tirozinaza (clona T311, Novocastra, diluţie1:40) şi Ki-67 (clona MIB1, DakoCytomation, diluţie 1:100).

Rezultate
Examenul histopatologic a confirmat suspiciunea clinică, evidențiind o structură microscopică de melanom malign, intens pigmentat, cu celule epitelioide, ulcerat central și cu o reacție inflamatorie moderată. Indicele Clark a fost III, iar indicele Breslow sub 1mm (663 microni). (Figurile 5-8).
Examenul imunohistochimic, efectuat cu ajutorul markerilor de diferențiere melanocitară, a arătat un marcaj nuclear și citoplasmatic intens și difuz al proteinei S100 în celulele tumorale. Imunomarcajul HMB45, Tirozinazei și Melan A a fost citoplasmatic intens în celulele de la nivelul limitei dermice a tumorii, fără descreșterea expresiei acestor markeri odată cu creșterea profunzimii, iar paternul imunoexpresiei a fost de tip patchy. Acești markeri au evidențiat prezența celulelor tumorale diseminate pagetoid în epiderm și extensia celulelor tumorale în și în jurul foliculilor piloși. Expresia nucleară a markerului de proliferare celulară Ki-67 a avut un nivel redus, sugerând o activitate proliferativă redusă în celulele tumorale.

Discuții
Melanomul malign este cea mai agresivă tumoră cutanată de origine melanocitară, cu evoluție rapidă și cu mare capacitate de metastazare[7,8]. Literatura de specialitate clasică și articolele rezultate din cercetări moderne subliniază că MMC este o tumoră care se dezvoltă, de regulă, pe un nev preexistent, dar poate lua naștere și pe un tegument aparent normal[9,10].
Incidenţa crescută în ultimele decade se datorează expunerii mai intense la radiaţii ultraviolete tip B (UV-B)[11,12] și reprezintă 1-3% din totalul tumorilor maligne și 7-8% din cele cutanate[13,14]. În ciuda progreselor terapeutice realizate, prognosticul pacienţilor cu MMC rămâne nefavorabil, iar datele statistice recente arată că media de supravieţuire variază între 6-8 luni, supravieţuirea la 5 ani fiind mai mică de 5%, cu sublinierea că MMC metastatic rămâne incurabil[15,16].
Managementul terapeutic al acestor pacienți s-a îmbunătățit permanent, dar nicio asociere de chimioterapice și/sau imunomodulatoare sau alte metode moderne fizioterapice sau chirurgicale nu au asigurat o vindecare de durată[17,18,19].
Cazul prezentat de noi, cu un indice de prognostic Clark III și Breslow de 663 microni, la care s-a intervenit târziu pentru excizia tumorii, ridică aceleași incertitudini privind stabilirea schemei terapeutice. Acesta necesită a fi discutat pentru faptul că pacientul a dezvoltat un MMC „de novo“ pe tegumente aparent indemne (fără nicio modificare prealabilă), expuse doar ocazional la soare, la vârsta când această patologie apare destul de rar. Evoluția lentă, care a depășit 2 ani, este neobișnuită pentru MMC[20,21].
Imunomarcajul cu markerii de difererențiere melanocitară: proteina S100, HMB45, Tirozinaza și Melan A, a evidențiat prezența celulelor tumorale diseminate pagetoid în epiderm, profunzimea tumorii la nivel dermic și extensia celulelor tumorale în și în jurul foliculilor piloși.
Expresia HMB45 a arătat absența maturării celulelor din profunzimea leziunii, astfel expresia acestui marker nu a descrescut odată cu creșterea adâncimii în derm. Dimpotrivă, celulele tumorale din profunzimea leziunii au exprimat intens acest marker, cu un pattern de tip patchy (Figura 9). O imunoexpresie similară s-a observat și în cazul Tirozinazei și a lui Melan A, acest aspect susținând lipsa de maturare a celulelor tumorale de la nivelul profund al leziunii. (Figurile 10,13)
Numeroase studii au demonstrat rolul antigenilor de difererențiere melanocitară (proteina S100, HMB45, Tirozinaza și Melan A) în distincția dintre melanoamele maligne și nevii melanocitari comuni sau displazici[22,23]. HMB45 este în mod special util în detectarea pattern-ului de maturare al nevilor, descreșterea expresiei acestui marker odată creșterea în profunzimea dermului sau expresia difuză pe toată suprafața leziunii fiind sugestive unui diagnostic benign, precum un nev. În contrast cu nevii, melanoamele cutanate primare exprimă, de obicei, HMB45 într-un pattern de tip patchy, cu celule izolate sau împrăștiate în toată suprafața dermului. Expresia Tirozinazei este foarte similară cu cea a lui HMB45[22].
Markerul de proliferare celulară Ki-67 a fost exprimat la un nivel redus în celulele melanocitare dermice, comparativ cu keratinocitele proliferative din straturile bazale ale epidermului (Figurile 11, 12). Acest aspect ar fi putut pune sub semnul întrebării diagnosticul de melanom malign, dar absența maturării celulelor tumorale din prufunzimea leziunii a orientat spre un melanom malign. Activitatea prioliferativă redusă evidențiată cu Ki-67 în cazul studiat, pe de o parte se corelează cu evoluția lentă pe care a avut-o leziunea și pe de altă parte sugerează o agresivitate redusă și evoluție favorabilă în continuare.
O expresie crescută a lui Ki-67 în melanoamele cutanate primare, corelată atât cu indicele Breslow, cât și cu prezența ulcerației, a fost raportată și de alte cercetări[24, 25]. Totuși, nu s-a demonstrat nicio legătură semnificativă cu prognosticul pacienților. Cu toate că alte studii imunohistochimice au arătat o corelație între expresia lui Ki-67 și prognosticul pacienților cu melanom[26], acestea luau în considerare tumori cu o grosime mai mare[27]. În studiul lui Witold Kycler din 2006, antigenul Ki-67 a fost detectat în zona nucleară a celulelor tumorale de melanom primar, în 70% din cazuri și s-a demonstrat o corelație statistică cu probabilitatea de supraviețuire sau deces. Este foarte probabil ca nivelul expresiei lui Ki-67 să se dovedească a fi util în determinarea agresivității și a potentialului metastatic al melanoamelor[28].

Concluzii
În majoritatea cazurilor, melanomul malign se dezvoltă pe un nev preexistent, dar poate lua naștere și „de novo“, în general la persoanele tinere, evoluția sa fiind rapidă. Cei mai predispuși sunt indivizii care se încadrează în fototipul I sau II, iar factorul de risc cel mai important în dezvoltarea tumorii este expunerea excesivă la radiații ultraviolete.
Importanța acestui caz constă în faptul că tumora a prezentat niște particularități neobișnuite: s-a format pe tegument sănătos, a evoluat lent, pacientul avea vârsta de peste 50 de ani, se încadra în fototipul III, iar teritoriul cutanat pe care a apărut leziunea fusese expus rareori la radiații ultraviolete. Coroborând toate aceste date, cazul s-a dovedit interesant și demn de luat în calcul de către literatura de specialitate.
Datele clinico-statistice publicate, precum și experiența clinică acumulată, scot în evidență necesitatea stabilirii unor reguli de monitorizare pentru perioade mai lungi și a unei categorii mai largi de populație cu risc crescut (purtători de nevi displazici, sporadici sau familiali, persoane cu profesii ce presupun expunerea îndelungată la raze UV naturale sau artificiale, indivizi cu fototip I sau antecedente personale/familiale de MMC etc.).
Imunomarcajul cu markeri ai diferențierii melanocitare este important în diagnosticul diferențial al nevilor melanocitari displazici de melanoamele maligne cutanate, în timp ce imunomarcajul cu markerul de proliferare celulară Ki-67 este foarte util în determinarea agresivității și a potențialului metastatic al melanoamelor maligne cutanate dezvoltate „de novo“.
Tendința tinerilor din societatea de astăzi, de a exagera cu orice preț expunerea la raze UV este extrem de riscantă și impune un anumit nivel de educație sanitară privind vestimentația adecvată, precum și utilizarea rațională și eficientă a protecției solare cu produse „ecran“.
Din datele de mai sus rezultă că MMC continuă să reprezinte o preocupare importantă pentru cercetarea biologică și clinică și, atâta vreme cât nu există un tratament considerat standard real, cazurile cu metastaze ar trebui incluse în studii clinice sistematice.

Bibliografie

1. Robin LH, Wittekind C. UICC/AJCC – Cancerele pielii. In: TNM – clasificarea tumorilor maligne. 6th ed, Editura Ministerului Sănătăţii, 2005, 123-130.
2. Liu ZJ, Herlyn M. Melanoma. In: DeVita VT, Hellman S, Rosenberg SA (ed). Cancer: principles and practice of oncology. 7th ed, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, 2005, 1745-1824.
3. Eggermont AM. Adjuvant therapy in malignant melanoma: an update based on randomized trials. 17th International Congress on Anti-Cancer Treatment Abstract Book, Paris, 2006, 40-43.
4. Kirkwood JM, Ibrahim JG, Sondak VK, et al. High- and low-dose interferon alfa-2b in high-risk melanoma: first analysis of Intergroup trial E1690/S9111/C9190. J Clin Oncol, 2000, 18(12):2444-2458.
5. Wagner WR, Casciato DA. Skin cancers. In: Casciato DA (ed). Manual of clinical oncology. 5th ed, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, 2004, 355-358.
6. Wagner JD, Gordon MS, Chuang TY, et al. Current therapy of cutaneous melanoma. Plast Reconstr Surg, 2000, 105(5):1774-1799.
7. Albertini MR, Longley J, Harary PM, et al. Cutaneous melanoma. In: Chang AE, Ganz PA, Hayes DF (ed). Oncology – an evidence based approach. Springer, New York, 2006, 1073-1092.
8. Burmeister BH, Smithers BM, Poulsen MG. Skin and melanoma cancer. In: Pollock RE (ed). UICC Manual of oncology. 9th ed, Wiley & Sons, New York, 2003, 325-340.
9. Hegge PU, Gause B. Skin cancers and melanoma. In: Abraham J, Allegra CJ, Gulley J (ed). Bethesda handbook of clinical oncology. 2nd ed, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, 2005, 283-307.
10. Wagner WR Jr, Casciato DA. Skin cancers. In Casciato DA (ed). Manual of clinical oncology. 5th ed, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, 2005, 355-368.
11. Manola J, Atkins M, Ibrahim J, et al. Prognostic factors in metastatic melanoma: a pooled analysis of Eastern Cooperative Oncology Group trials. J Clin Oncol, 2000, 18(22):3782-3793.
12. Tsao H, Cosimi AB, Sober AJ. Ultra-late recurrence (15 years or longer) of cutaneous melanoma. Cancer, 2001, 79(12):2361-2370.
13. Eggermont AMM, Keiholty U, et al. What is the role of biological response modifiers in the treatment of melanoma? In: Newton Bishop JA, Gore M (ed). Melanoma: critical debates. Blackwell Science, Oxford, 2002, 195-211.
14. Payene A. Skin cancers. In: Cassidy J, Bissett D, Obe AJS (ed). Oxford Handbook of oncology. 2nd ed, Oxford University Press, Oxford, 2010, 460.
15. Sabel SM, Sondak VK. Malignant melanoma: current state of primary and adjuvant treatment. Cancer Future, 2004, 3:76-82.
16. Ollila DW, Hsueh EC, Stern SL, et al. Metastasectomy for recurrent stage IV melanoma. J Surg Oncol, 2002, 71(4):209-213.
17. Jensen EH, Margolin KA, Sondak VK. Melanoma and other skin cancers. In: Pazdur R, Coia LR, Hoskins WJ (ed). Cancer management: a multidisciplinary approach. 10th ed, CMP Medica Oncology, New York, 2007, 523-554.
18. Jost LM, Jelic S, Purkalne G. ESMO minimum clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up of cutaneous malignant melanoma. Ann Oncol, 2005, 16(1):i66-i68.
19. Terando A, Sabel MS, Sondak VK. Melanoma: adjuvant therapy and other treatment options. Curr Treat Opt Oncol, 2003, 4(3):187-199.
20. Jost L. Cutaneous malignant melanoma: ESMO Minimum clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol, 2007, 18(2):ii71-ii73.
21. Rădulescu D., Stolnicu S., Dimitriu S. Consideratii clinico-morfologice în melanoamele maligne cutanate. Jurnalul de Chirurgie, 2006, 2(4):359-369.
22. Prieto VG, Shea CR, Reed JA: Anathema or useful? Application of immunohistochemistry to the diagnosis of melanocytic lesions. In: Shea CR, Reed JA and Prieto VG (ed). Pathology of Challenging Melanocytic Neoplasms:diagnosis and management, Springer, New York, 2015, 34-48.
23. Lohmann CM, Iversen K, Jungbluth AA, et al. Expression of melnocyte differentiation and ki-67 in nodal nevi and comparison of ki-67 expression with metastatic melanoma. Am J Surg Pathol, 2002, 26(10):1351-1357.
24. Hazan C, Melzer K, Panageas AS, et al. Evaluation of the proliferation marker MIB-1 in the prognosis of cutaneous malignant melanoma. Cancer, 2002, 95:634-640.
25. Henrique R, Azevedo R, et al. Prognostic value of Ki-67 expression in localized cutaneous malignant melanoma. J Am Acad Dermatol, 2003, 43(6):991-1000.
26. Ostmeier H, Fuchs B, Otto F, et al. Prognostic immunohistochemical markers of primary human melanomas. Br J Dermatol, 2001, 145:203-209.
27. Straume O, Sviland L, Arkslen LA. Loss of nuclear p16 protein expression correlates with increased tumor cell proliferation (Ki-67) and poor prognosis in patients with vertical growth phase melanoma. Clin Cancer Res, 2000, 6:1845-1853.
28. Kycler W, Grodecka-Gazdecka S, Bręborowicz J, Filas V, Teresiak M. Prognostic factors in melanoma. Rep Pract Oncol Radiother, 2006, 11(1): 39-48.